The Notch repressor complex in Drosophila: analysis of Hairless

Der Notch-Signalweg erlaubt die Kommunikation benachbarter Zellen und wird daher für die Regulation vielfältigster Entwicklungsprozesse benötigt. Wann immer Zellen in der Entwicklung unterschiedliche Differenzierungswege einschlagen wird dieser Signalweg aktiv, egal ob in Invertebraten wie Drosophila melanogaster oder in Vertebraten wie dem Menschen.

Namensgebend für diesen Signalweg ist der Notch-Rezeptor. Durch Bindung der Liganden Delta oder Serrate wird der Notch-Rezeptor intra-membran gespalten und die intrazelluläre Domäne (ICN) freigesetzt. ICN wirkt als Signalüberträger und gleichzeitig als transkriptioneller Ko-Aktivator der Notch-Zielgene. Im Zellkern baut sich ein Aktivatorkomplex aus mehreren Proteinen auf. Im Zentrum steht das DNA-Bindeprotein CSL (Abk. aus humanem CBF-1, Su(H) von D. melanogaster und lag-2 von C. elegans), das an ICN sowie an Mam bindet, welches ebenfalls als Koaktivator wirkt. Die Struktur des Aktivatorkomplexes, gebunden an DNA, wurde für Vertebraten sowie für den Fadenwurm C. elegans kristallographisch entschlüsselt. Die großen Sequenzübereinstimmungen lassen vermuten, dass der Komplex in Drosophila weitgehend gleich aufgebaut ist.

Uns interessiert, wie der Notch-Signalweg inaktiviert wird. In Drosophila existiert ein genereller Antagonist mit dem Namen Hairless, der gemeinsam mit Su(H) und den Korepressoren Groucho (Gro) und C-terminales Bindeprotein (CtBP) einen Repressorkomplex aufbaut und die Transkription der Notch-Zielgene hemmt. Hairless bindet direkt an Su(H) und an die beiden Korepressoren. Trotz der hohen Konservierung aller beteiligten Komponenten (Notch, CSL, mam, Gro, CtBP), wurde ein Hairless Homolog bisher nur in Insekten gefunden. Wir versuchen derzeit in Kollaboration mit Prof. Dr. R. Kovall (University of Cincinnati, USA), die Struktur des Repressorkomplexes zu entschlüsseln.

Unsere Arbeiten zeigen, dass Hairless die C-terminale Domäne (CTD) von Su(H) bindet, die auch von ICN und von Mam kontaktiert wird. Derzeit versuchen wir die Aminosäuren zu bestimmen, die für diesen Kontakt nötig sind. Außerdem haben wir die Su(H)-Bindedomäne in Hairless exakt auf die sog. NT-Box eingegrenzt: in dieser NT-Box haben wir eine Aminosäure identifiziert, die den Kontakt an Su(H) vermittelt und deren Mutation die Bindung stört bzw. vollständig unterdrückt. Die entsprechenden Mutanten zeigen in vivo die erwarteten Funktionsausfälle und untermauern somit unsere Arbeitshypothese.

Um die Mutanten in vivo untersuchen zu können, werden wir gene-engineering anwenden. Dazu wir der endogene Locus mittels homologer Rekombination durch eine attP Landestelle ersetzt, an die im nächsten Schritt mittels orstspezifischer Rekombination das mutierte Gen eingefügt werden kann. Auf diese Weise lassen sich gezielt Mutationen erzeugen und deren Auswirkungen auf das Tier bzw. auf die Notch-Signaltransduktion untersuchen.