Membraneinbau und Orientierung von Proteinen in Liposomen

Um die molekularen Grundlagen des Mechanismus der Membraninsertion eines Proteins zu verstehen,
untersuchen wir das nur 44 Aminosäuren lange Hüll(coat)protein des Pseudomonas-Phagen Pf3. Dieses einfach strukturierte Protein mit einer einzigen transmembranen Region wird transient in die Cytoplasmamembran des Wirtsbakteriums eingebaut, bevor es die neue Phagenhülle bildet. Um den Einbauprozess unabhängig vom Phagenzyklus studieren zu können wurde das Gen des Hüllproteins in ein Expressionsplasmid kloniert und in E. coli exprimiert. Der Membraneinbau kann dann in vivo mit pulse-chase und protease-mapping Experimenten untersucht werden. Zudem kann der Einbauprozess in in vitro Experimenten durch Untersuchung der Proteininsertion in isolierte Membranvesikel und auch in künstlich hergestellte Lipidvesikel (Liposomen) verfolgt werden. Insbesondere in den in vitro Systemen kann die äußerst wichtige Frage nach den Determinanten, die die Orientierung eines Proteins in der Membran bestimmen, detailliert bearbeitet werden. Hierfür wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese eine Reihe von Mutanten des Pf3 coat Proteins hergestellt und die Mutanten wurden auf ihre Membranorientierung hin untersucht. Wir stellten fest, dass die in den N- und C-terminalen Bereichen des Pf3 Proteins befindlichen, geladenen Aminosäuren die Orientierung in der Membran maßgeblich bestimmen. Mutanten, deren geladene Aminosäuren in Aminosäurereste mit jeweils entgegengesetzter Ladung verändert wurden, wurden mit umgekehrter Orientierung in die Membran eingebaut. Eine Pf3 Mutante, welche keine geladenen Aminosäurereste mehr besitzt, konnte nicht in die Membran inserieren. Wurde jedoch in einer solchen Mutante der transmembrane Bereich verlängert, so wurde die Membraninsertion restauriert. Die Energetik und Dynamik des Insertionsprozesses sowie die Abhängigkeit der Insertion von der Insertase YidC wird an fluoreszenzmarkierten Pf3-Derivaten an Proteoliposomen mit fluoreszenzoptischen Methoden analysiert.

The autonomous lipid insertion of double-spanning membrane proteins

Membrane assembly of proteins into the bacterial cytoplasmic membrane is driven by and dependent on a set of proteinaceous machineries like the SecYEG translocase, the YidC insertases or the SRP (signal recognition particle). In addition, chaperones and chaperone-like protein complexes often are involved. Basically all inner membrane proteins need more or less assistance by these machineries in finding their correct location and topology in the membrane lipid bilayer.

Recently, however we found evidence for a small subset of hydrophobic proteins that suggestively are assembled into the membrane autonomously without the help of any of the known insertion and translocation machineries.

We focussed on bacterial sensor proteins which insert into the membrane independent of SRP, Sec and YidC. They are translocated in their correct topology into the inner bacterial membrane in Sec- YidC and Ffh-depleted E. coli strains, respectively. Liposome insertion studies are under progress.

Prospective: In the current research in this project we are setting up fluorescent-based in vitro translocation systems to analyze in detail the insertion events into membrane vesicles as well as into liposomes. The influence of the membrane potential is studied and also the role of different lipids. With a set of chimeric mutant proteins the kinetics but also limits of autonomous insertion into liposomes and proteoliposomes will be determined.